みなさん、こんにちは。

 

前回は、植物プロトプラスト作製のための酵素液を作りましたが、

今回は、実際にプロトプラストを作製する様子をお届けします。

 

最初にお断りしておきますが、

今回の実験では、細胞融合の観察を目的としておりますので、

その後の培養を視野に入れておりません。

 

そのため、無菌的に作業をしていないことを承知の上で、

ご覧ください。

 

それでは、スタートです。

 

サンプルとして利用するレッドオニオンは、

ムラサキ色の色素を含む細胞がある部分を取ってきて・・・、

 

シャーレ内の酵素液につけます。

 

 

 

 

 

 

 

 

 

また、チンゲンサイの葉肉細胞のプロトプラストを得るために、

裏側表皮を剥離して、その葉肉部分を酵素液につけます。

 

そして、振盪しながら酵素反応をスタート・・・。

 

変なキャラクターがシャーレの上に乗っておりますが、

気にしないでください。

 

早くプロトプラストができるように、

おまじないだそうです。

 

「しゃれ（シャーレ）にならないな。」なんて、

ダジャレは言わないでください。

 

しばらく酵素反応をしたものを、

倒立顕微鏡で観察すると・・・、

 

アーリレッドは、このような感じ。

 

チンゲンサイは、このような感じです。

 

見づらいかもしれませんが、

一つ一つの丸いものが、プロトプラストです。

 

次回も、お楽しみに・・・。

 

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みなさん、こんにちは。

 

１年生の細胞組織学実習で、

植物プロトプラストを作製しました。

 

プロトプラストとは、

細胞壁のある細胞から細胞壁を取り除いた細胞（原形質体）をいいます。

 

細胞壁のある細胞を細胞融合するときには、

細胞壁があると融合できませんので、

あらかじめ細胞壁を取り除いておかなければなりません。

 

そのため、酵素により細胞壁を分解して、

プロトプラストの状態にするのです。

 

まずは植物プロトプラストの作製に使う試薬調整から・・・

 

卒業生をご採用いただいている、

ヤクルト本社製の「マセロザイムＲ－１０」と

「セルラーゼオノヅカＲ－１０」を使用します。

 

「マセロザイムＲ－１０」は、

植物の細胞と細胞を接着している接着物質を分解して、

細胞を単離する酵素です。

 

「セルラーゼオノヅカＲ－１０」は、

植物細胞の細胞壁を加水分解する酵素です。

 

これらを使って、

植物プロトプラストを作製するための酵素液を調整します。

 

ですがこれらは酵素なので、

その調整にはいくつかの配慮が必要です。

 

まず第一に氷冷しながら、

調整すること・・・。

 

氷冷といっても、氷だけで冷やすのではなく、

冷却効率を上げるために、氷水で冷やしましょう。

 

次に泡立てないように穏やかに撹拌しながら、

調整すること・・・。

 

酵素の失活を極力防ぐために、重要です。

 

そして、特別な指示がない限りは、

酵素は最後に入れること・・・。

 

デリケートな酵素を扱うときには、

やはり扱い方に注意が必要ですね。

 

そして、酵素液を保存するときには、

調整後すぐに濾過滅菌して、

１回分ずつ分注、冷凍保存しておきます。

 

ちなみに今回の酵素液は、

細胞単離酵素である「マセロザイムＲ－１０」と、

細胞壁分解酵素である「セルラーゼオノヅカＲ－１０」を

混ぜた酵素液なので、

酵素反応をワンステップで行う一段（階）法で利用する酵素液となります。

 

一方、第１ステップで細胞単離を単離させ、

第２ステップで細胞壁を分解する二段（階）法という方法もありますが、

この場合には細胞単離酵素と細胞壁分解酵素を別の酵素液として調整する必要があります。

 

いずれの場合も、

できてくるのは細胞壁の無いプロトプラストなので、破裂しないように、

酵素液にはソルビトールやマンニトールを加えて高張液としておく必要があります。

 

だいぶお話が長くなってしまいましたので、

続きは次の機会にいたします。

 

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2年生の細胞工学実習で

細胞培養を始めました。

 

起こした細胞の倍加時間が20時間なので、

2日に１回お世話をします。

 

培地、PBS、トリプシンを37℃恒温槽で温めます。

 

細胞を観察して、

どれくらい細胞が増えているのか判定します。

 

理想は80％confluent 程度です。

 

細胞数が少なくても、

一か所に固まって増えているときも継代を行います。

 

培養フラスコ底面の細胞の割合を5か所以上判定、

平均して全体の細胞数を求めます。

 

細胞の記録は写真に残します。

ピント合わせが難しいです。

 

細胞数が決まったら作業開始です。

培地を取り除き、細胞表面をPBSで洗います。

 

細胞に直接溶液を当ててしまうとはがれてしまうので、

注意しながら溶液を加えます。

 

トリプシンを加えて、

細胞を培養フラスコ底面から剥がします。

 

反応後、細胞が剥がれているかどうかは

倒立顕微鏡で観察します。

 

細胞のふちがキラキラして丸くなってきたらOKです。

 

培地を加えてトリプシンの反応を止めて、

ピペッティングにより細胞をバラバラにします。

 

泡立てないように気を付けて行います。

 

2日後に8割になるように、

2割分の細胞を新しい培地の入った培養フラスコへ移し、

再び培養を開始します。

 

細胞培養が始まると細胞が中心ですので、

放課後、土曜日などお世話が欠かせません。

 

大変ですけれど、

ちゃんと行えばちゃんと増えていきます。

 

手順をしっかり覚えて、

細胞にストレスを与えないように作業していきましょう。

 

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みなさん、こんにちは。

 

１年生の細胞組織学実習で、

アスパラガス茎頂培養を行いました。

 

市販のアスパラガスを殺菌して、

使用します。

 

茎頂摘出の練習は事前にしておりましたが、

本番を迎え・・・

 

少し緊張気味のようでした。

 

しかし、はじまってしまえば・・・。

 

茎頂を実体顕微鏡下で摘出し・・・、

 

培地に置床・・・、

 

着実に作業を進めているようでした。

 

ウイルスフリー苗の作出に使われる、

この基本技術・・・。

 

しっかりと経験できましたか？

 

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みなさん、こんにちは。

 

１年生の植物バイオの授業で、課題発表を行いました。

 

以下の６つのテーマについてをパワーポイントにまとめ、発表をしてもらうというものです。

 

１．茎頂培養

※写真撮影を忘れてしまいました。

すみません。

 

２．ウイルス検定

 

３．葯培養

 

４．胚培養

 

５．細胞融合

 

６．植物遺伝子組換え

 

パワーポイントの使用もはじめてという人もいましたが、それぞれユニークなところもあったり、みなさん、うまく発表できていたと思います。

よかったです。

 

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2年生の細胞工学実習で細胞培養を開始しました。

 

起こした翌日は培地交換です。

 

昨日起こした細胞を観察します。

一部に偏って培養されていたり、

多すぎる場合には継代培養になります。

 

培地をアスピレーターで取り除きます。

細胞面から吸わないようにします。

 

PBS(－)で2回細胞を洗います。

 

新しい37℃培地を加えます。

 

さらに培養を続けます。

次は継代を行います。

 

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2年生の細胞工学実習で、

細胞培養を開始しました。

 

凍結保存されていた細胞を起こします。

 

先ずは、４℃の培地を遠沈管に取ります。

 

セラムチューブ内で凍っている細胞を、

３７℃恒温槽で融解します。

 

完全には融解せずに、

ちょっと氷が残るくらいにします。

 

先ほど取っておいた４℃培地の一部を、

セラムチューブ内の細胞を懸濁し、遠沈管へ。

 

遠心して細胞を集めます。

 

培地をアスピレーターで取り除きます。

 

３７℃培地を加えて細胞浮遊液をつくります。

 

培養フラスコへ細胞浮遊液を移します。

倒立顕微鏡で細胞を確認します。

 

３７℃、５％炭酸ふ卵器内で培養を開始です。

しっかり起こせたでしょうか・・・。

 

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2年生の細胞工学実習で、

培地調製を行いました。

 

培地調製に必要な器具を準備します。

 

下のフィルターホルダーへ、

湿潤したメンブレンフィルターをのせます。

 

はみ出さないように注意します。

 

上のフィルターホルダーをのせて。

 

締めます。

 

二重にしたアルミホイルに包んで。

 

その他の器具も一緒にオートクレーブ滅菌します。

滅菌後、クリーンベンチ内で培地調製を行います。

 

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