2年生の免疫化学実習では、モノクローナル抗体を作製するために、細胞融合を行いました。
手順は
①マウスに抗原を腹腔内投与して抗体を作らせます。
②骨髄腫細胞であるミエローマ細胞を培養します。このミエローマ細胞はHAT選択培地に感受性なHGPRT欠損株を使用します。
マウスから脾臓を取り出し、すりつぶして細胞を集めます。最初は赤血球も混じっているので沈殿は赤みがかっています。
0.83%塩化アンモニウムを加えて赤血球を溶血させると、沈殿（細胞）は白くなります。。
培地に細胞を浮遊させて、一部をとり、細胞数をカウントします。
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脾細胞(抗体産生細胞)とミエローマ細胞を10：1で混和します。
遠心して細胞を集めます。
今回はPEG(ポリエチレングリコール)を使って細胞融合を行います。
PEG 1mlを3秒に1滴の速度で細胞に滴下していきます。
今度は、培地10mlを1.5秒に1滴の速度で加えPEGを希釈します。
遠心後、細胞をHAT培地へ浮遊させます。
96ウエル培養プレートへ入れて培養を開始します。
96ウエル培養プレート内には。。。
融合細胞(ハイブリドーマ)として①抗体産生細胞とミエローマ細胞、②抗体産生細胞と抗体産生細胞、③ミエローマ細胞とミエローマ細胞の3種類が考えられます。
また、融合できなかった抗体産生細胞とミエローマ細胞が一緒に培養されます。
必要なハイブリドーマは①抗体産生細胞とミエローマ細胞です。これ以外はいらないのでHAT選択培地を用いて培養することによって、HAT選択培地感受性のミエローマ細胞は死滅(de novo経路が働かないので)、抗体産生細胞は寿命により死滅していくので最後に残るのは目的の抗体を産生するハイブリドーマになります。
たくさんハイブリドーマが出来ますように。。。(^_^)v
そして、マウスの抗体産生細胞とミエローマ細胞(骨髄腫細胞)を細胞融合します。
