2年生の免疫化学実習ではモノクローナル抗体作製を行いました。
目的の抗体を産生する細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマ(融合細胞)がえられました。
今回はELISA法を行い培養上清の抗体価を調べて、ハイブリドーマのクローニングを行います。
前日、抗原を入れておいた96ウエルのELISAプレートをブロッキングします。
96ウエル全てに、BSA溶液をすり切り一杯入れていきます。
泡立てないように、入れ忘れないように。みんな真剣です。
1時間のブロッキング後、ハイブリドーマのプレートから培養上清を無菌的にとり、対応するELISAプレートへと入れていきます。
この培養上清が1次抗体です。
この作業は細胞を浮遊させないように、コンタミしないように行わなければならないので慎重に行います。
班員の数より、プレートの方が多いので大変です(^^;)
抗原と1次抗体を1時間反応。次にペルオキシダーゼ標識2次抗体を反応させます。
最後に基質を入れて発色を待ちます。
抗体価が強い程色が濃く発色します。今回は緑色に発色する基質です。
ハイブリドーマのプレートとELISAプレートは対応させているので確認しながら行います。
発色の強いウエル数カ所のハイブリドーマをピペッティングにより浮遊させHT培地へ集めます。
浮遊させた細胞は新しい96ウエルプレートへまいていきます。
抗体価の強いハイブリドーマは希釈されて、新しい96ウエルプレートへ。
限界希釈法によるクローニング操作です。
何回かクローニングを行うことにより、１ウエルに1つの細胞が入ることになります。
1つの細胞が産生した抗体はモノクローナル抗体ということとなります。
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