2年生の免疫化学実習ではモノクローナル抗体作製を行いました。

目的の抗体を産生する細胞とミエローマ細胞を融合してハイブリドーマ(融合細胞)がえられました。

今回はELISA法を行い培養上清の抗体価を調べて、ハイブリドーマのクローニングを行います。

前日、抗原を入れておいた96ウエルのELISAプレートをブロッキングします。

96ウエル全てに、BSA溶液をすり切り一杯入れていきます。

泡立てないように、入れ忘れないように。みんな真剣です。

1時間のブロッキング後、ハイブリドーマのプレートから培養上清を無菌的にとり、対応するELISAプレートへと入れていきます。

この培養上清が1次抗体です。

この作業は細胞を浮遊させないように、コンタミしないように行わなければならないので慎重に行います。

班員の数より、プレートの方が多いので大変です(^^;)

抗原と1次抗体を1時間反応。次にペルオキシダーゼ標識2次抗体を反応させます。

最後に基質を入れて発色を待ちます。

抗体価が強い程色が濃く発色します。今回は緑色に発色する基質です。

ハイブリドーマのプレートとELISAプレートは対応させているので確認しながら行います。

発色の強いウエル数カ所のハイブリドーマをピペッティングにより浮遊させHT培地へ集めます。

浮遊させた細胞は新しい96ウエルプレートへまいていきます。

抗体価の強いハイブリドーマは希釈されて、新しい96ウエルプレートへ。

限界希釈法によるクローニング操作です。

何回かクローニングを行うことにより、１ウエルに1つの細胞が入ることになります。

1つの細胞が産生した抗体はモノクローナル抗体ということとなります。

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2年生の免疫化学実習ではモノクローナル抗体の作製を行いました。

マウスに抗原を免疫して、マウスの抗体産生細胞とミエローマ細胞をPEGを用いて細胞融合しました。

その後、HAT培地中で培養して、生き残った細胞が目的のハイブリドーマ(融合細胞)です。

HAT培地で培養していたハイブリドーマの培地交換を行いました。これからは、HT培地で培養を続けます。

まずは、培地をアスピレーターで半分ほど取り除きます。

吸引マスターです。アスピレーター担当。

古い培地を吸引した後は、新しい培地(HT培地)を2滴づつ96ウエルマルチプレートへ入れていきます。

枚数が多いと大変ですね♪

クリーンベンチ内での操作もお手の物(^o^)

ハイブリドーマが元気に育ちますように。

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2年生の免疫化学実習では「モノクローナル抗体」を作製しました。

7月末から定期的に抗原となるタンパク質をBALB/cマウスへ腹腔内投与しました。

マウスの体の中で抗体が作られていきます。

クリーンベンチ内でマウスの脾臓を摘出し、メッシュの上で脾臓をすりつぶして細胞を集めます。

すりつぶしたら、細胞を遠心管へ集めて遠心します。

赤い沈殿が脾細胞です。

アスピレーターで上清を取り除きます。

沈殿には赤血球が混ざっているので、赤血球を溶血させて取り除きます。

脾細胞だけになったら、培養液へ脾細胞を浮遊させます。

脾細胞浮遊液の一部はトリパンブルーで染色し、血球計算板を用いて細胞数と生存率を求めます。

脾細胞と融合するのは、ミエローマ細胞です。脾細胞：ミエローマ細胞＝10:1で細胞融合します。

必要なミエローマ数を脾細胞の遠心管へ加えて遠心します。

融合する2つの細胞へ1mLの50％PEG(ポリエチレングリコール)を3秒に1滴の早さで滴下します。細胞が均一にPEG中に分散するように、穏やかに攪拌します。

PRG添加後、直ちにタッピング、そして10mLの培地を1.5秒に1滴の早さで加えていきます。PEGの希釈が終わったら、遠心してPEGを取り除きます。

細胞をHAT培地へ浮遊して、96ウエルのマイクロプレートへ入れていきます。

37℃、5％ CO2インキュベーター内で培養を開始します。

HAT選択によって、抗体を産生する脾細胞とミエローマ細胞が融合したハイブリドーマ(融合細胞)だけが生き残ります。

たくさんできますように。

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