1年生の遺伝子操作学実習でプラスミドの調製を行いました。
3回目はプラスミド調製キットを使用して抽出しました。
キットの溶液は、
BufferA1、BufferA2、BufferA3と順番に使用していきます。
原理はアルカリSDS法とだいたい同じなので、前回の操作を思い出しながら行いましょう。
BufferA2には青い色がついています。
この溶液で溶菌します。操作は穏やかに。
BufferA3で中和します。
青い色が消えるまで転倒混和します。
消えたら中和完了です。
遠心します。
上清を取り、Collection Tubeへセットしたカラムへ入れます。
遠心すると、カラムに付いているメンブレンにDNAが吸着します。
エタノールの入っているBufferAQでメンブレンを洗浄・乾燥します。
カラムをマイクロチューブへ移し、溶出液を加えます。
遠心するとメンブレンに吸着していたDNAが溶出されて出来上がりです。
キットを使用すると、あっという間に(カタログによると14分間)プラスミドを調製することができます。
便利ですね(^^♪
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1年生の遺伝子操作学実習でプラスミドの調製を行いました。
今回はアルカリSDS法で抽出します。
プラスミド保有菌をマイクロチューブへ取り、遠心して菌体を集めます。
アルカリSDS法は、
SolutionI、SolutionⅡ、SolutionⅢと順番に入れていきます。
SolutionⅡは溶菌。
SDSにより菌体の細胞膜構造を破壊し、NaOHにより染色体DMAを変性させます。
SolutionⅢは中和。
酢酸カリウムで溶液のpHを中性に戻します。
攪拌すると乳白色のおからのような沈殿が見られます。
遠心します。
沈殿と浮遊している、おからを吸わないように注意しながら、
上清を新しいマイクロチューブへ取ります。
アルコール沈殿を行いプラスミドをペレットにします。
真空デシケーターで乾燥させます。
TEにペレットを溶解したら、プラスミド溶液の出来上がりです。
アルカリSDS法では主に、閉環状DNAが調製できます。
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1年生の遺伝子操作学実習でプラスミドの調製を行いました。
今回はボイル法です。
全培養したプラスミド保有菌をマイクロチューブへ取ります。
遠心して菌体を集めます。
STET、リゾチームを入れて菌体を再浮遊します。
リゾチームは菌体の細胞壁を破壊します。
沸騰水浴中で煮沸(ボイル)します。
遠心すると、菌体の染色体DNAと変性タンパク質が沈殿します。
プラスミドは溶液中の存在します。
沈殿は必要ないので取り除きます。
アルコール沈殿を行うと、核酸は水に溶解していられなくなり、
凝集して沈殿となります。
遠心してプラスミドを回収します。
TEに溶解して、プラスミド溶液の出来上がりです。
ちゃんと調製できたかをアガロースゲル電気泳動で確認します。
矢印の位置で光っているのがプラスミド(DNA)です。
左のレーンはRNAを除去したプラスミド溶液。
右のレーンはRNAを除去していない溶液です。
プラス側に長く伸びて見えるのがRNAです。
バンドが確認できたのでプラスミドが調製出来たようです。
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