2年生の遺伝子工学実習でサザンハイブリダイゼーションを行いました。
作製した組換えDNA(プラスミド)により大腸菌を形質転換しました。
今回は形質転換菌について調べていきます。
形質転換菌を前培養。
そこから、プラスミドを調製、制限酵素でプラスミドを切断しました。
アガロースゲル電気泳動でDNAを分離、染色後、アガロースゲル中のDNAを変性、中和して１本鎖にしました。
メンブレンへDNAを移すために装置をつくります。
Bufferをしみこませた濾紙の上に処理したアガロースゲルをのせます。
次に、メンブレンを静かにのせます。1発勝負でお願いします。
メンブレンの上に濾紙、ペーパータオル、最後に重しをのせて一晩置きます。
1本鎖のDNAがメンブレンにうつります。
次の日、そぉーっと重し、ペーパータオル、濾紙を外します。
まずは、アガロースゲルとメンブレンの間に空気が入っていないか確認して、入っていたら印をつけます。
アガロースゲルの大きさも透けて見えるので印をつけておきます。
メンブレンとアガロースゲルをくるっと逆さまにして、メンブレンの上にアガロースゲルがのるようにします。
サンプル溝がわかるように印をつけます。
Bufferでメンブレンを洗ってから自然乾燥。
乾いたら、80℃で2時間加熱することによってDNAをメンブレンに固定させます。
次はメンブレン上におけるDNAのハイブリダイゼーションを行います。
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