2年生の遺伝子工学実習でサザンハイブリダイゼーションを行いました。
まず、プレハイブリ液を調製します。
salmon sperm DNAをスピッツグラスへ入れて、沸騰水浴中で加熱してDNAを1本鎖にします(DNAの変性)。
加熱後、直ちに氷水中へつけて、急冷します(DNAを1本鎖のままに保ちます)。
その他の試薬を加えます。
ブロッティング、ベーキングが終わったメンブレンフィルターを用意します。
ポリエチレン袋にメンブレンとプレハイブリ液を加えて密封し、42℃ 恒温槽に沈めて2時間反応させます。
反応中に、今度はハイブリ液を調製します。
ハイブリ液にはビオチン標識プローブが入っています。
salmon sperm DNAと一緒に沸騰水浴中で加熱し、DNAを変性させてその他の試薬を加えます。
大事なビオチン標識プローブを忘れずに入れてくださいね。このプローブにより目的の遺伝子を見つけます。
ポリエチレン袋に密封し、恒温槽に沈めて１晩反応させます。
次の日、洗浄、検出操作しました。
メンブレンが発色しました。
標識プローブは相補的にメンブレン上のDNAと結合します。
したがって、発色したバンドは標識プローブ(目的の遺伝子)と同じ塩基配列を持っていることがわかります。
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