みなさん、こんにちは。
１０月１２（土）・１３（日）の湘央祭では、多くの方にご来場いただきました。
ありがとうございました。
応用生物科学科では、
２年生が各グループでテーマを決め、展示発表を行いました。
「化粧水をつくりました」
「実験動物って？」
「医薬品の種類と効果の違いについて」
「食中毒について」
「皮膚や心臓にも変身できる細胞～幹細胞～」
「大腸菌の形質転換」
限られた準備期間の中、よく頑張っていたと思います。
ご来場いただき、発表を聞いてくださったみなさん、
ありがとうございました。
質問もたいへんありがたかったです。
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2年生の免疫化学実習では、
モノクローナル抗体の作製を行っています。
前回、PEGで細胞融合を行った細胞は、HAT培地で培養中です。
今回はHT培地へ培地交換を行います。
培地を半分アスピレーターで吸って減らします。
新しい培地を2滴5mLピペットで2滴加えます。
96ウエルプレートに触れないように、
滴下していきます。
かなり集中して滴下するので眼が疲れます…。
ハイブリドーマが元気に育つといいですね。
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2年生の免疫化学実習では、
モノクローナル抗体の作製を行っています。
今回は細胞融合です。
１）脾細胞の調製
抗原を免疫してあるマウス（BALB/c）から
脾細胞を回収します。
クリーンベンチ内でマウスから脾細胞を取り出し、
メッシュですりつぶし培地へ浮遊させます。
遠心して細胞を集めます。
この赤い沈殿は脾細胞と赤血球です。
赤血球溶解bfferを加えて、赤血球を壊します。
遠心して脾細胞を集めます。
脾細胞だけなので沈殿は白っぽくなりました。
上清を取り除き、
培地へ脾細胞を浮遊させます。
２）細胞数を求めます。
調製した脾細胞の一部をトリパンブルー液で染色し、
生細胞数を求めます。
同様に、
培養していたミエローマ細胞（SP2/0）の生細胞数も求めます。
脾細胞は5000万~1億個取れました。
３）PEG（ポリエチレングリコール）による細胞融合
脾細胞と1/10量のミエローマ細胞を、遠心管へ入れます。
遠心して上清を取り除き、
細胞をタッピングによりほぐします。
50%PEGを1分間かけて細胞に滴下していきます。
チューブを振り攪拌しながら滴下します。
PEG添加後、
今度は培地を10分間かけて滴下していきます。
PEGをゆっくりと希釈します。
希釈が終わったら遠心して細胞を集めます。
HAT培地へ浮遊させ、
組織培養用96ウエルプレートへ巻いていきます。
37℃、5%炭酸ふ卵器で培養します。
HAT選択により、
脾細胞とミエローマ細胞が融合した細胞だけが生き残り、
増殖する予定です。
たくさん融合しますように。。。
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みなさん、こんにちは。
１・２期に渡り実施していた、
１年生の細胞組織学実習・・・。
その最後に実技試験を行いました。
今まで、
植物組織培養の基本技術について学んできましたが・・・、
その集大成として、
基本技術に立ち戻り・・・、
実技試験として、
無菌播種の作業をしていただきました。
慣れてくると、
基本操作が雑になりがちですが、
そういうこともなく・・・
しっかりと作業ができていました。
無菌操作はバイオ分野では基本技術の一つですので、
これからいろいろと経験していきますが、
きれいに見える、
しっかりとした技術を身につけていきましょう。
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みなさん、こんにちは。
１年生の組織細胞学実習では、
主に植物を扱ってきました。
サンプルで使用後のお野菜は、
食べるために持ち帰りますが、
実習中の息抜きに、
工作したりする方も時々見られます。
それを実習の番外編として、
少しご紹介しましょう。
プロトプラスト作製のため、
サンプルを取った後のアーリーレッド・・・。
フジツボみたいな形ですが・・・、
指輪だそうです・・・・・・・・・・。
個・性・的ですね。
こちらもアーリーレッドから作られた・・・・・、
小さなイス
・・・だそうです。
こちらは、
プロトプラスト作製のため、
サンプルを取った後のチンゲンサイ・・・。
お・ば・け
と・・・・・・・・・
かぶとむし（星付き）
だということです。
成長点を摘出した後のアスパラガスは・・・・・、
タケノコに見えるからでしょうか！？
こちらは、
小さな人物像（中央）です。
ホワイトボードには・・・・・
ユニークな絵が・・・・・。
見ている人によっては、
怒る対象にされたりしないかな？
学生の息抜きなので、
お許しください。
ごめんなさい。
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みなさん、こんにちは。
今日は、
作製したアーリーレッドとチンゲンサイのプロトプラストを
回収するところからはじめます。
まずは、プロトプラストを含む、
それぞれの酵素反応液をナイロンメッシュで濾過をして、
未反応組織の残渣などを取り除きます。
そして、酵素液を取り除き、
プロトプラストを集めるために、遠心機で遠心します。
遠心した後のアーリーレッドプロトプラストです。
こちらは、チンゲンサイプロトプラストです。
上清を捨てて、酵素を取り除き、
洗浄液を加えてプロトプラストを再浮遊、
さらに遠心します。
アーリレッドとチンゲンサイのプロトプラストを
適度な細胞数になるように洗浄液を加えて調整し、
２種のプロトプラストを混ぜます。
そして、そのプロトプラスト溶液の周囲に融合剤である、
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を配置します。
そして、倒立顕微鏡で観察しながら、
プロトプラスト溶液とＰＥＧを混ぜると・・・、
赤矢印のように細胞融合が観察できました。
今回の実習では、
植物プロトプラストの細胞融合の様子を観察することが目的ですが、
実際の技術にも通じる経験にもなったことでしょう。
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みなさん、こんにちは。
前回は、アーリーレッドとチンゲンサイの
プロトプラスト作製作業をご覧いただきましたが、
それをもう少し詳しく見ていきましょう。
アーリーレッドの、
プロトプラストができていく様子をご覧いただきます。
最初の方は、このように細胞は細長い形状をしておりますが・・・
酵素反応が進んでいくと、
徐々に細胞と細胞の接着物質が分解されると同時に、
細胞壁が分解されていき、少しずつ丸くなっていきます。
さらに酵素反応が進むと、このようになります。
写真を見ると、
プロトプラストが互いにくっついているように見えますが、
これは振盪しながら酵素反応をしているため、
シャーレの中央にプロトプラストが集まっているからです。
チンゲンサイのプロトプラストも前回ご覧いただきましたが、
少し拡大して見てみましょう。
葉肉細胞なので、
プロトプラストの細胞膜の内側にへばりつくような形で、
緑色の粒のように見える葉緑体を観察することができます。
元気なプロトプラストは、
細胞膜の内側に均一に葉緑体が存在しますが、
元気がなくなってくると、これが不均一に存在するようになります。
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みなさん、こんにちは。
前回は、植物プロトプラスト作製のための酵素液を作りましたが、
今回は、実際にプロトプラストを作製する様子をお届けします。
最初にお断りしておきますが、
今回の実験では、細胞融合の観察を目的としておりますので、
その後の培養を視野に入れておりません。
そのため、無菌的に作業をしていないことを承知の上で、
ご覧ください。
それでは、スタートです。
サンプルとして利用するレッドオニオンは、
ムラサキ色の色素を含む細胞がある部分を取ってきて・・・、
シャーレ内の酵素液につけます。
また、チンゲンサイの葉肉細胞のプロトプラストを得るために、
裏側表皮を剥離して、その葉肉部分を酵素液につけます。
そして、振盪しながら酵素反応をスタート・・・。
変なキャラクターがシャーレの上に乗っておりますが、
気にしないでください。
早くプロトプラストができるように、
おまじないだそうです。
「しゃれ（シャーレ）にならないな。」なんて、
ダジャレは言わないでください。
しばらく酵素反応をしたものを、
倒立顕微鏡で観察すると・・・、
アーリレッドは、このような感じ。
チンゲンサイは、このような感じです。
見づらいかもしれませんが、
一つ一つの丸いものが、プロトプラストです。
次回も、お楽しみに・・・。
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みなさん、こんにちは。
１年生の細胞組織学実習で、
植物プロトプラストを作製しました。
プロトプラストとは、
細胞壁のある細胞から細胞壁を取り除いた細胞（原形質体）をいいます。
細胞壁のある細胞を細胞融合するときには、
細胞壁があると融合できませんので、
あらかじめ細胞壁を取り除いておかなければなりません。
そのため、酵素により細胞壁を分解して、
プロトプラストの状態にするのです。
まずは植物プロトプラストの作製に使う試薬調整から・・・
卒業生をご採用いただいている、
ヤクルト本社製の「マセロザイムＲ－１０」と
「セルラーゼオノヅカＲ－１０」を使用します。
「マセロザイムＲ－１０」は、
植物の細胞と細胞を接着している接着物質を分解して、
細胞を単離する酵素です。
「セルラーゼオノヅカＲ－１０」は、
植物細胞の細胞壁を加水分解する酵素です。
これらを使って、
植物プロトプラストを作製するための酵素液を調整します。
ですがこれらは酵素なので、
その調整にはいくつかの配慮が必要です。
まず第一に氷冷しながら、
調整すること・・・。
氷冷といっても、氷だけで冷やすのではなく、
冷却効率を上げるために、氷水で冷やしましょう。
次に泡立てないように穏やかに撹拌しながら、
調整すること・・・。
酵素の失活を極力防ぐために、重要です。
そして、特別な指示がない限りは、
酵素は最後に入れること・・・。
デリケートな酵素を扱うときには、
やはり扱い方に注意が必要ですね。
そして、酵素液を保存するときには、
調整後すぐに濾過滅菌して、
１回分ずつ分注、冷凍保存しておきます。
ちなみに今回の酵素液は、
細胞単離酵素である「マセロザイムＲ－１０」と、
細胞壁分解酵素である「セルラーゼオノヅカＲ－１０」を
混ぜた酵素液なので、
酵素反応をワンステップで行う一段（階）法で利用する酵素液となります。
一方、第１ステップで細胞単離を単離させ、
第２ステップで細胞壁を分解する二段（階）法という方法もありますが、
この場合には細胞単離酵素と細胞壁分解酵素を別の酵素液として調整する必要があります。
いずれの場合も、
できてくるのは細胞壁の無いプロトプラストなので、破裂しないように、
酵素液にはソルビトールやマンニトールを加えて高張液としておく必要があります。
だいぶお話が長くなってしまいましたので、
続きは次の機会にいたします。
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2年生の細胞工学実習で
細胞培養を始めました。
起こした細胞の倍加時間が20時間なので、
2日に１回お世話をします。
培地、PBS、トリプシンを37℃恒温槽で温めます。
細胞を観察して、
どれくらい細胞が増えているのか判定します。
理想は80％confluent 程度です。
細胞数が少なくても、
一か所に固まって増えているときも継代を行います。
培養フラスコ底面の細胞の割合を5か所以上判定、
平均して全体の細胞数を求めます。
細胞の記録は写真に残します。
ピント合わせが難しいです。
細胞数が決まったら作業開始です。
培地を取り除き、細胞表面をPBSで洗います。
細胞に直接溶液を当ててしまうとはがれてしまうので、
注意しながら溶液を加えます。
トリプシンを加えて、
細胞を培養フラスコ底面から剥がします。
反応後、細胞が剥がれているかどうかは
倒立顕微鏡で観察します。
細胞のふちがキラキラして丸くなってきたらOKです。
培地を加えてトリプシンの反応を止めて、
ピペッティングにより細胞をバラバラにします。
泡立てないように気を付けて行います。
2日後に8割になるように、
2割分の細胞を新しい培地の入った培養フラスコへ移し、
再び培養を開始します。
細胞培養が始まると細胞が中心ですので、
放課後、土曜日などお世話が欠かせません。
大変ですけれど、
ちゃんと行えばちゃんと増えていきます。
手順をしっかり覚えて、
細胞にストレスを与えないように作業していきましょう。
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