1年生の微生物学実習で初代培養を行いました。
細胞を一週間培養し、マウスアデノウイルスを感染させました。
さらに1週間培養し、細胞変性効果(CPE)を倒立顕微鏡で観察しました。
感染前は全面にのびていた細胞が。。。
円形化したり、膨化したり細胞が変性しています。
ウイルス濃度が高いウエルでは細胞間に隙間が空き、変性して丸くなっていました。
ウイルスは小さいので直接観察することはできません。
細胞に感染させることで、その存在を知ることができます。
今年度は細胞がとてもよい状態で培養できましたので、
細胞変性効果がわかりやすく、観察できました。
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1年生の微生物学実習で初代培養を行いました。
トリプシン液へ細かく切った腎臓細胞を入れ、一晩反応させました。
次の日のトリプシン液は。。。
細胞片はバラバラになり、溶液が濁っています。
細胞浮遊液を遠心して、細胞を集めます。
培地へ再浮遊させてから、ロートでろ過して組織片などを取り除きます。
細胞浮遊液の細胞数をカウントして30万個/mLになるように調整します。
24ウエルマイクロプレートへ細胞浮遊液を入れ、５％炭酸ふ卵器で培養を開始します。
翌日、その後2日おきに、培地交換を行います。
培地をアスピレーターで吸って取り除きます。
新しい培地を加えていきます。
1週間後、
細胞がプレート全体に広がっている様子が観察できました。
次回は、マウスアデノウイルスを感染させます。
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2年生の免疫化学実習では、モノクローナル抗体を作製しています。
今回はメンブレンの抗原と、保存していた培養上清(1次抗体)を反応させます。
前日にブロッキングをしたメンブレンを、短冊状に切ります。
パラフィルムを貼った容器へ、メンブレンを並べて反応を行います。
11枚のうち3枚はコントロールとして使います。
①1次抗体無し、2次抗体有り
②1次抗体無し、2次抗体無し
③1次抗体(陽性）必ず発色するものです。
残りのメンブレンは、保存した溶液(陽性になった培養上清)を1次抗体とします。
ELISAと同様に、
1次抗体→洗浄→2次抗体→基質→発色の反応を、
メンブレン上で行います。
洗浄はチューブに1枚ずつ入れて。。。
基質を入れて発色させます。
乾燥させたら、もとに戻して考察します。
左のメンブレンの結果を見てみると、
サンプル３は陽性コントロールです。
褐色のバンドが１つ見られます。
１つだけ反応しているので、｢モノクローナル抗体｣です。
サンプル９は褐色のバンドが複数見られるので、｢ポリクローナル抗体｣です。
もう一度クローニングをする必要があります。
目的のハイブリドーマを得るまでの道のりは遠い。。。
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2年生の免疫化学実習では、モノクローナル抗体を作製しています。
クローニングした細胞の培養上清を使って、ELISAを行います。
抗原の入っているELISAプレートと、細胞上清を対応させて移していきます。
ELISAを行い、抗体価の高い細胞上清を探します。
並行してウエスタンブロッティングを行います。
抗原をSDS-PAGE電気泳動で分離し、ゲル中の抗原をPVDF膜へを写し取ります。
ブロッティングが終わったPVDF膜は、
抗原と分子量マーカーの部分を切り離して、
アミドブラック染色します。
残りの部分は、ブロッキング液へ一晩漬けて、ブロッキングします。
ELISAで発色した培養上清は、マイクロチューブへ保存して、
ウエスタンブロッティングの1次抗体として使用します。
翌日、いよいよモノクローナル抗体ができているのかがわかります。
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みなさん、こんにちは。
１０月１２（土）・１３（日）の湘央祭では、多くの方にご来場いただきました。
ありがとうございました。
応用生物科学科では、
２年生が各グループでテーマを決め、展示発表を行いました。
「化粧水をつくりました」
「実験動物って？」
「医薬品の種類と効果の違いについて」
「食中毒について」
「皮膚や心臓にも変身できる細胞～幹細胞～」
「大腸菌の形質転換」
限られた準備期間の中、よく頑張っていたと思います。
ご来場いただき、発表を聞いてくださったみなさん、
ありがとうございました。
質問もたいへんありがたかったです。
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2年生の免疫化学実習では、
モノクローナル抗体の作製を行っています。
前回、PEGで細胞融合を行った細胞は、HAT培地で培養中です。
今回はHT培地へ培地交換を行います。
培地を半分アスピレーターで吸って減らします。
新しい培地を2滴5mLピペットで2滴加えます。
96ウエルプレートに触れないように、
滴下していきます。
かなり集中して滴下するので眼が疲れます…。
ハイブリドーマが元気に育つといいですね。
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2年生の免疫化学実習では、
モノクローナル抗体の作製を行っています。
今回は細胞融合です。
１）脾細胞の調製
抗原を免疫してあるマウス（BALB/c）から
脾細胞を回収します。
クリーンベンチ内でマウスから脾細胞を取り出し、
メッシュですりつぶし培地へ浮遊させます。
遠心して細胞を集めます。
この赤い沈殿は脾細胞と赤血球です。
赤血球溶解bfferを加えて、赤血球を壊します。
遠心して脾細胞を集めます。
脾細胞だけなので沈殿は白っぽくなりました。
上清を取り除き、
培地へ脾細胞を浮遊させます。
２）細胞数を求めます。
調製した脾細胞の一部をトリパンブルー液で染色し、
生細胞数を求めます。
同様に、
培養していたミエローマ細胞（SP2/0）の生細胞数も求めます。
脾細胞は5000万~1億個取れました。
３）PEG（ポリエチレングリコール）による細胞融合
脾細胞と1/10量のミエローマ細胞を、遠心管へ入れます。
遠心して上清を取り除き、
細胞をタッピングによりほぐします。
50%PEGを1分間かけて細胞に滴下していきます。
チューブを振り攪拌しながら滴下します。
PEG添加後、
今度は培地を10分間かけて滴下していきます。
PEGをゆっくりと希釈します。
希釈が終わったら遠心して細胞を集めます。
HAT培地へ浮遊させ、
組織培養用96ウエルプレートへ巻いていきます。
37℃、5%炭酸ふ卵器で培養します。
HAT選択により、
脾細胞とミエローマ細胞が融合した細胞だけが生き残り、
増殖する予定です。
たくさん融合しますように。。。
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みなさん、こんにちは。
１・２期に渡り実施していた、
１年生の細胞組織学実習・・・。
その最後に実技試験を行いました。
今まで、
植物組織培養の基本技術について学んできましたが・・・、
その集大成として、
基本技術に立ち戻り・・・、
実技試験として、
無菌播種の作業をしていただきました。
慣れてくると、
基本操作が雑になりがちですが、
そういうこともなく・・・
しっかりと作業ができていました。
無菌操作はバイオ分野では基本技術の一つですので、
これからいろいろと経験していきますが、
きれいに見える、
しっかりとした技術を身につけていきましょう。
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みなさん、こんにちは。
１年生の組織細胞学実習では、
主に植物を扱ってきました。
サンプルで使用後のお野菜は、
食べるために持ち帰りますが、
実習中の息抜きに、
工作したりする方も時々見られます。
それを実習の番外編として、
少しご紹介しましょう。
プロトプラスト作製のため、
サンプルを取った後のアーリーレッド・・・。
フジツボみたいな形ですが・・・、
指輪だそうです・・・・・・・・・・。
個・性・的ですね。
こちらもアーリーレッドから作られた・・・・・、
小さなイス
・・・だそうです。
こちらは、
プロトプラスト作製のため、
サンプルを取った後のチンゲンサイ・・・。
お・ば・け
と・・・・・・・・・
かぶとむし（星付き）
だということです。
成長点を摘出した後のアスパラガスは・・・・・、
タケノコに見えるからでしょうか！？
こちらは、
小さな人物像（中央）です。
ホワイトボードには・・・・・
ユニークな絵が・・・・・。
見ている人によっては、
怒る対象にされたりしないかな？
学生の息抜きなので、
お許しください。
ごめんなさい。
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みなさん、こんにちは。
今日は、
作製したアーリーレッドとチンゲンサイのプロトプラストを
回収するところからはじめます。
まずは、プロトプラストを含む、
それぞれの酵素反応液をナイロンメッシュで濾過をして、
未反応組織の残渣などを取り除きます。
そして、酵素液を取り除き、
プロトプラストを集めるために、遠心機で遠心します。
遠心した後のアーリーレッドプロトプラストです。
こちらは、チンゲンサイプロトプラストです。
上清を捨てて、酵素を取り除き、
洗浄液を加えてプロトプラストを再浮遊、
さらに遠心します。
アーリレッドとチンゲンサイのプロトプラストを
適度な細胞数になるように洗浄液を加えて調整し、
２種のプロトプラストを混ぜます。
そして、そのプロトプラスト溶液の周囲に融合剤である、
ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）を配置します。
そして、倒立顕微鏡で観察しながら、
プロトプラスト溶液とＰＥＧを混ぜると・・・、
赤矢印のように細胞融合が観察できました。
今回の実習では、
植物プロトプラストの細胞融合の様子を観察することが目的ですが、
実際の技術にも通じる経験にもなったことでしょう。
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