2年生の免疫化学実習では、抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングをＥＬＩＳＡ法で行いました。
96ウエルのＥＬＩＳＡ用プレートに抗原を入れます。
４℃へ１晩入れてプレート底面に抗原タンパク質を吸着させます。
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翌日、抗原溶液を捨て、１％ＢＳＡでブロッキングします。
抗原のところだけが反応するように余分な部分をブロックします。
こうすることで抗体や標識抗体のプレートへの非特異的吸着を抑えることができます。
ブロッキングが終わったら、１次抗体を入れて抗原と反応させます。
１次抗体はハイブリドーマの培養上清です。
ハイブリドーマの培養プレートとＥＬＩＳＡ用プレートを対応させて培養上清を移していきます。
間違えないように。。。そして、培養プレートを汚染しないように。。
次は、１次抗体を抗原として認識する２次抗体を入れて反応させます。
２次抗体は酵素で標識されているので基質を入れると酵素反応がおこります。
反応時間にはハイブリドーマの観察をしたり、次の準備をしたり。。
最後に基質を入れて発色を待ちます。
目的の抗原に対する抗体があれば緑色に発色します。
色が濃ければたくさん抗体があるってことです。
発色したウエルと対応している培養プレートにハイブリドーマが存在していれば当たり！！
いくつかの陽性ウエルから細胞を集めて、培地へ浮遊させ、クローニングを行います。。
何度かクローニングを行うことで１ウエル中に１コの細胞が入るようになります。
９６ウエル培養プレートでまたハイブリドーマを培養し、次回はＥＬＩＳＡ法とウエスタンブロットを行います。
