2年生の細胞工学実習で

細胞培養を始めました。

起こした細胞の倍加時間が20時間なので、

2日に１回お世話をします。

培地、PBS、トリプシンを37℃恒温槽で温めます。

細胞を観察して、

どれくらい細胞が増えているのか判定します。

理想は80％confluent 程度です。

細胞数が少なくても、

一か所に固まって増えているときも継代を行います。

培養フラスコ底面の細胞の割合を5か所以上判定、

平均して全体の細胞数を求めます。

細胞の記録は写真に残します。

ピント合わせが難しいです。

細胞数が決まったら作業開始です。

培地を取り除き、細胞表面をPBSで洗います。

細胞に直接溶液を当ててしまうとはがれてしまうので、

注意しながら溶液を加えます。

トリプシンを加えて、

細胞を培養フラスコ底面から剥がします。

反応後、細胞が剥がれているかどうかは

倒立顕微鏡で観察します。

細胞のふちがキラキラして丸くなってきたらOKです。

培地を加えてトリプシンの反応を止めて、

ピペッティングにより細胞をバラバラにします。

泡立てないように気を付けて行います。

2日後に8割になるように、

2割分の細胞を新しい培地の入った培養フラスコへ移し、

再び培養を開始します。

細胞培養が始まると細胞が中心ですので、

放課後、土曜日などお世話が欠かせません。

大変ですけれど、

ちゃんと行えばちゃんと増えていきます。

手順をしっかり覚えて、

細胞にストレスを与えないように作業していきましょう。

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2年生の細胞工学実習で細胞培養を開始しました。

起こした翌日は培地交換です。

昨日起こした細胞を観察します。

一部に偏って培養されていたり、

多すぎる場合には継代培養になります。

培地をアスピレーターで取り除きます。

細胞面から吸わないようにします。

PBS(－)で2回細胞を洗います。

新しい37℃培地を加えます。

さらに培養を続けます。

次は継代を行います。

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2年生の細胞工学実習で、

細胞培養を開始しました。

凍結保存されていた細胞を起こします。

先ずは、４℃の培地を遠沈管に取ります。

セラムチューブ内で凍っている細胞を、

３７℃恒温槽で融解します。

完全には融解せずに、

ちょっと氷が残るくらいにします。

先ほど取っておいた４℃培地の一部を、

セラムチューブ内の細胞を懸濁し、遠沈管へ。

遠心して細胞を集めます。

培地をアスピレーターで取り除きます。

３７℃培地を加えて細胞浮遊液をつくります。

培養フラスコへ細胞浮遊液を移します。

倒立顕微鏡で細胞を確認します。

３７℃、５％炭酸ふ卵器内で培養を開始です。

しっかり起こせたでしょうか・・・。

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2年生の細胞工学実習で、

培地調製を行いました。

培地調製に必要な器具を準備します。

下のフィルターホルダーへ、

湿潤したメンブレンフィルターをのせます。

はみ出さないように注意します。

上のフィルターホルダーをのせて。

締めます。

二重にしたアルミホイルに包んで。

その他の器具も一緒にオートクレーブ滅菌します。

滅菌後、クリーンベンチ内で培地調製を行います。

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2年生の細胞工学実習で、

培地調製を行いました。

滅菌された器具をクリーンベンチへ入れて、

調製開始です。

細胞を培養するためのDMEM培地です。

滅菌水へ粉末を入れて、溶解させます。

黄色い溶液ですね。

炭酸水素ナトリウムを加えると、

赤く色が変化します。

抗生物質を添加し、

最後に血清(FBS+CS)を加えます。

調製できたら、ろ過滅菌を行います。

まず、シリンジに培地と空気を入れ、

フィルターが使用できるかチェックします。

培地入りのシリンジにフィルターをつけて、

元のビーカーへシリンジ内の培地をろ過します。

溶液が全部ろ過出来て、

空気が通らなかったらOKです。

使用できないフィルターは内筒が軽く押せたり、

フィルターホルダーの横から培地が出てきたりしちゃいます。

フィルターが使用できるのを確認したら、

滅菌済みの瓶へ培地をろ過していきます。

滅菌が終わった培地の一部をディッシュに取り、

インキュベーターへ一晩おいて、

コンタミチェックをします。

培地が出来たら、

いよいよ細胞を起こします(^^♪

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2年生の遺伝子工学実習で、

コロニーハイブリダイゼーションを行いました。

形質転換した菌が生えているシャーレに

メンブレンフィルターを密着させて、

コロニーの細菌をメンブレンに写し取ります。

写し取った細菌を処理して、

１本鎖にしたDNA分子を

メンブレンフィルターへ固定します。

以前行った、

サザンブロッティングのメンブレンフィルターと共に、

ハイブリダイゼーションを行います。

ハイブリダイゼーションでは、

塩基配列の相補性を利用して、

特定の塩基配列や遺伝子が検出できます。

コロニーハイブリダイゼーションでは、

メンブレン上に写し取ったコロニー内に、

目的の遺伝子が存在するかどうかがわかります。

サザンブロッティングしたメンブレンでは、

目的の遺伝子の存在と、

そのDNA断片の大きさもわかります。

検出するには、

標的となる特定の配列のすべて、

または、

一部に対して相補的な一本鎖DNA(RNA)をもとに

作製された標識プローブを用います。

メンブレンフィルターに固定された一本鎖DNAと

標識プローブの塩基配列が同じ、または似ていれば、

相補的に二本鎖を形成します。

今回の標識プローブは、

酵素が標識してあるので、

基質と反応させて発色を得ます。

発色しているところには、

目的の遺伝子が存在していることになります。

コロニーハイブリダイゼーション↓

サザンハイブリダイゼーション↓

コロニーハイブリダイゼーションで

発色している場所のコロニーを培養すると、

目的の遺伝子を持つ細菌が得られます。

サザンハイブリダイゼーションで

発色しているDNA断片は目的の遺伝子と、

同じ塩基配列を持つことがわかります。

操作が多く、

時間がかかり、

発色するまで結果がわからないので、

今何が起こっているのかを

考えながら取り組むことが大切ですね。

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2年生の遺伝子工学実習が始まりました。

久しぶりの実習なので、

班員で協力しながらアガロースゲルを調製しました。

今回はアルカリ法により、

プラスミドを調製しました。

試薬をマイクロチューブへ加えたら、

試験管ミキサーを使って混ぜます。

各自、操作法をテキストで確認しながら行います。

空き時間には実習ノートをまとめます。

2年生の実習は1日(1~4時限)実習です。

やる内容も盛りだくさん。

反応時間、電気泳動時間や染色時間など、

待ち時間を有効に使って実習していけるようにしていきます。

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2年生の細胞工学実習で細胞培養が始まりました。

細胞を起こした翌日は培地交換を行います。

細胞の様子を倒立顕微鏡で観察します。

今回の細胞は接着細胞なので、フラスコ底面にいます。

細胞を剥がさないようにPBS(－)で洗います。

洗浄後、新しい培地を加え培養を続けます。

張り付かなかった細胞や不純物を取り除くことで、

細胞にとって増殖しやすい環境をつくります。

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2年生の細胞工学実習で細胞培養が始まりました。

凍結保存してあった細胞を起こします。

セラムチューブ内の細胞を37℃で溶かします。

少し氷が残るくらいでクリーンベンチへ。

4℃培地を加えてピペッティング後、培地へ浮遊させます。

遠心して細胞を集めます。

培地をアスピレーターで取り除いたら、

新しい37℃培地へ再浮遊させます。

ピペッティング後、ディッシュ(またはフラスコ)へ入れます。

細胞を全体へ広げて、５％CO２インキュベーター内で培養します。

起こしの操作は素早く行った方が生存率が高いです。

元気に起きますように(^^♪

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