2年生の免疫化学実習ではモノクローナル抗体を作製しています。
前回、ウエスタンブロティングでPVDF膜に抗原を写し取り、ブロッキングを一晩行いました。
大きかったメンブレンを短冊状に10等分して箱に入れて、1次抗体、2次抗体、基質と反応させていきます。
原理は96ウエルプレートかメンブレンかが違うだけで、ほぼELISA法と同じです。
それぞれ反応が終わったら洗浄し、次の反応液をのせます。
洗浄は15ｍℓの遠心管へ洗浄液とメンブレンを入れて1本ずつ洗浄していきます。
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洗浄は5から6回しっかりと洗浄します。
振盪機をを使う班もいれば、試験管立てにまとめてダンスしながら洗浄する班やら、
地味に数本づつ手動で振盪する班。。。さまざまです。
しっかりと洗浄しないとバックが汚くなったり、非特異的な発色が出てしまいます。
基質と反応させて発色していたら目的の抗原に対する抗体があるってことです。
アミドブラックで染色した抗原のバンドと分子量マーカーのバンド、切り刻んだメンブレンを元のように戻します。
メンブレン状に褐色に発色しているバンドがあると、目的の抗原に対する抗体があるということになります。
左3のメンブレンは下の方に、右3では上の方に濃いバンドが見られます。
発色しているバンドが1本だけだったら、モノクローナル抗体ですが、ここには他の場所にも発色が見られるので、まだ、モノではありませんね(>_<)
でも、発色が見られたのでよかったです！
何度かクローニング、ウエスタンブロティングを繰り返してモノクローナル抗体にしていきます。
