2年生の免疫化学実習では、モノクローナル抗体を作製しています。

今回はメンブレンの抗原と、保存していた培養上清(1次抗体)を反応させます。

前日にブロッキングをしたメンブレンを、短冊状に切ります。

パラフィルムを貼った容器へ、メンブレンを並べて反応を行います。

11枚のうち3枚はコントロールとして使います。

①1次抗体無し、2次抗体有り

②1次抗体無し、2次抗体無し

③1次抗体(陽性）必ず発色するものです。

残りのメンブレンは、保存した溶液(陽性になった培養上清)を1次抗体とします。

ELISAと同様に、

1次抗体→洗浄→2次抗体→基質→発色の反応を、

メンブレン上で行います。

洗浄はチューブに1枚ずつ入れて。。。

基質を入れて発色させます。

乾燥させたら、もとに戻して考察します。

左のメンブレンの結果を見てみると、

サンプル３は陽性コントロールです。

褐色のバンドが１つ見られます。

１つだけ反応しているので、｢モノクローナル抗体｣です。

サンプル９は褐色のバンドが複数見られるので、｢ポリクローナル抗体｣です。

もう一度クローニングをする必要があります。

目的のハイブリドーマを得るまでの道のりは遠い。。。

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2年生の免疫化学実習では、モノクローナル抗体を作製しています。

クローニングした細胞の培養上清を使って、ELISAを行います。

抗原の入っているELISAプレートと、細胞上清を対応させて移していきます。

ELISAを行い、抗体価の高い細胞上清を探します。

並行してウエスタンブロッティングを行います。

抗原をSDS-PAGE電気泳動で分離し、ゲル中の抗原をPVDF膜へを写し取ります。

ブロッティングが終わったPVDF膜は、

抗原と分子量マーカーの部分を切り離して、

アミドブラック染色します。

残りの部分は、ブロッキング液へ一晩漬けて、ブロッキングします。

ELISAで発色した培養上清は、マイクロチューブへ保存して、

ウエスタンブロッティングの1次抗体として使用します。

翌日、いよいよモノクローナル抗体ができているのかがわかります。

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2年生の免疫化学実習では、

モノクローナル抗体の作製を行っています。

前回、PEGで細胞融合を行った細胞は、HAT培地で培養中です。

今回はHT培地へ培地交換を行います。

培地を半分アスピレーターで吸って減らします。

新しい培地を2滴5mLピペットで2滴加えます。

96ウエルプレートに触れないように、

滴下していきます。

かなり集中して滴下するので眼が疲れます…。

ハイブリドーマが元気に育つといいですね。

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