みなさん、こんにちは。
２年生の生化学実習では、
ゲルろ過クロマトグラフィーを行いました。
ゲルろ過クロマトグラフィーは、
カラムクロマトグラフィーに分類されます。
ゲルを詰めたカラムで分離された物質を分取し、
分析を行います。
ゲルろ過クロマトグラフィーは、
分子量の違いによって分離されます。
したがって前回のＳＤＳ－ＰＡＧＥ法と同様に、
物質の分子量を求めることができます。
今回は、アミラーゼ（タンパク質、酵素）の
分子量を求めました。
実習は、カラムにゲルを詰める作業からスタートです。
詰め過ぎも詰め足らずもダメなので慎重に詰めていきます。
次にサンプルを塗布します。
ゲルを乱さないように驚異の集中力発揮中、
慎重に慎重に！！！！！
溶出液（緩衝液）を追加しながら、
分離された物質を分取します。
色付きは分子量マーカーです。
早速、分離が始まりました。
下から青色、赤色、黄色が確認できます。
黄色がすべて溶出されたら終了です。
今回は、１ｍＬずつ分取しました。
分取後、
吸光度測定と今回は試料にアミラーゼを用いましたので、
ヨウ素デンプン反応を行いました。
分取した溶液は、青色、赤色、黄色の溶液になっています。
これらの溶液の吸光度を測定します。
ヨウ素デンプン反応でアミラーゼの確認をします。
デンプン溶液にヨウ素を加えると青紫色になります。
アミラーゼは、デンプンを分解しますので、
アミラーゼが分取された試験管は、青紫色になりません。
試験管立ての中央あたりは色がありません。
この部分にアミラーゼが含まれます。
吸光度測定とヨウ素デンプン反応の結果から、
アミラーゼの分子量を求めます。
分取した試験管の本数が多く、
吸光度測定も大変でしたが、
グラフの作成も大変そうでした。
青紫色にならない試験管がある程度の範囲でありましたが、
ヨウ素デンプン反応も確認ができました。
ちょっと長めの実習になりましたが、
アミラーゼの分子量も求められました。
２年生のみなさん、ゲルを詰める作業からの実習、
お疲れ様でした。
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