みなさん、こんにちは。

 

２年生の生化学実習では、

ゲルろ過クロマトグラフィーを行いました。

 

ゲルろ過クロマトグラフィーは、

カラムクロマトグラフィーに分類されます。

 

ゲルを詰めたカラムで分離された物質を分取し、

分析を行います。

 

ゲルろ過クロマトグラフィーは、

分子量の違いによって分離されます。

 

したがって前回のＳＤＳ－ＰＡＧＥ法と同様に、

物質の分子量を求めることができます。

 

今回は、アミラーゼ（タンパク質、酵素）の

分子量を求めました。

 

実習は、カラムにゲルを詰める作業からスタートです。

詰め過ぎも詰め足らずもダメなので慎重に詰めていきます。

 

次にサンプルを塗布します。

ゲルを乱さないように驚異の集中力発揮中、

慎重に慎重に！！！！！

 

溶出液（緩衝液）を追加しながら、

分離された物質を分取します。

 

色付きは分子量マーカーです。

早速、分離が始まりました。

 

下から青色、赤色、黄色が確認できます。

黄色がすべて溶出されたら終了です。

 

今回は、１ｍＬずつ分取しました。

 

分取後、

吸光度測定と今回は試料にアミラーゼを用いましたので、

ヨウ素デンプン反応を行いました。

 

分取した溶液は、青色、赤色、黄色の溶液になっています。

これらの溶液の吸光度を測定します。

 

ヨウ素デンプン反応でアミラーゼの確認をします。

デンプン溶液にヨウ素を加えると青紫色になります。

 

アミラーゼは、デンプンを分解しますので、

アミラーゼが分取された試験管は、青紫色になりません。

 

試験管立ての中央あたりは色がありません。

この部分にアミラーゼが含まれます。

 

吸光度測定とヨウ素デンプン反応の結果から、

アミラーゼの分子量を求めます。

 

分取した試験管の本数が多く、

吸光度測定も大変でしたが、

グラフの作成も大変そうでした。

 

青紫色にならない試験管がある程度の範囲でありましたが、

ヨウ素デンプン反応も確認ができました。

 

ちょっと長めの実習になりましたが、

アミラーゼの分子量も求められました。

 

２年生のみなさん、ゲルを詰める作業からの実習、

お疲れ様でした。

 

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